Una forma clásica de obtener imágenes de estructuras a nanoescala en las células es con microscopios de súper resolución, costosos y de alta potencia. Como alternativa, los investigadores del MIT han desarrollado una forma de estirar el tejido antes de obtener imágenes, una técnica que les permite lograr una resolución a nanoescala con microscopios ópticos convencionales.
En la última versión de la técnica, los investigadores han hecho posible crecer tejido 20 veces en un solo paso. Este método simple y económico podría allanar el camino para que casi cualquier laboratorio de biología realice imágenes a nanoescala.
“Esto democratiza la obtención de imágenes”, afirma Laura Kessling, profesora de Química de Novartis en el MIT y miembro del Instituto Broad del MIT y Harvard y del Instituto Koch para la Investigación Integrativa del Cáncer del MIT. “Sin este método, si quieres ver cosas con alta resolución, tienes que usar microscopios muy caros. Esta nueva técnica te permite ver cosas que normalmente no puedes ver con un microscopio estándar. “El valor de las imágenes porque “Puedo ver cosas a nanoescala sin la necesidad de una instalación especial”.
Con la resolución lograda por esta técnica, que es de unos 20 nanómetros, los científicos pueden ver orgánulos y grupos de proteínas dentro de las células.
“El aumento de veinte veces te lleva al ámbito en el que operan las moléculas biológicas. Los componentes básicos de la vida son cosas a nanoescala: biomoléculas, genes y productos genéticos”, dice Edward Boyden, profesor de neurotecnología en el MIT y Eva Tan; profesor de ingeniería biológica, artes y ciencias de los medios y ciencias cognitivas y del cerebro; Investigador del Instituto Médico Howard Hughes; y miembro del Instituto McGovern para la Investigación del Cerebro del MIT y del Instituto Koch para la Investigación Integrativa del Cáncer.
Boyden y Kiessling son los autores principales del nuevo estudio, que aparecerá en Los caminos de la naturaleza. Los estudiantes graduados del MIT Xiui Wang y Tay Won Shin PhD ’23 son los autores principales del artículo.
Misma extensión
El laboratorio de Boyden inventó la microscopía de aumento en 2015. Esta técnica implica incrustar el tejido en un polímero absorbente y descomponer las proteínas que normalmente mantienen unido el tejido. Cuando se añade agua, el gel se hincha y separa las biomoléculas entre sí.
La versión original de la técnica, que magnificaba el tejido unas cuatro veces, permitió a los investigadores obtener imágenes con una resolución de unos 70 nanómetros. En 2017, el laboratorio de Boyden modificó el proceso para incluir un segundo paso de amplificación, logrando una amplificación total de 20 veces. Esto permite una resolución aún mayor, pero el proceso es más complicado.
“Hemos desarrollado varias tecnologías de escala 20 veces mayores en el pasado, pero requieren múltiples pasos de escala”, dice Boyden. “Si puedes hacer esa cantidad de expansión en un solo paso, las cosas pueden ser un poco más fáciles”.
Con un aumento de 20 veces, los investigadores pueden alcanzar una resolución de unos 20 nanómetros, utilizando microscopios ópticos convencionales. Esto les permite ver estructuras celulares como microtúbulos y mitocondrias, así como grupos de proteínas.
En el nuevo estudio, los investigadores decidieron ampliar 20 veces con un solo paso. Esto significó que tuvieron que encontrar un gel que fuera muy absorbente y mecánicamente estable, para que no se rompiera al expandirlo 20 veces.
Para conseguirlo, utilizaron un gel compuesto por N,N-dimetilacrilamida (DMAA) y acrilato de sodio. A diferencia de los geles extendidos anteriores que dependen de la adición de otra molécula para formar enlaces cruzados entre las hebras de polímero, este gel forma enlaces cruzados espontáneamente y exhibe fuertes propiedades mecánicas. Estos componentes del gel se utilizaban anteriormente en protocolos de microscopía de aumento, pero los geles resultantes sólo podían ampliarse diez veces. El equipo del MIT optimizó el gel y el proceso de polimerización para fortalecer el gel y permitir una expansión 20 veces mayor.
Para estabilizar aún más el gel y aumentar su reproducibilidad, los investigadores eliminaron el oxígeno de la solución de polímero antes de la gelificación, lo que evita reacciones secundarias que interfieren con la reticulación. Este paso requiere hacer pasar gas nitrógeno a través de la solución de polímero, que reemplaza la mayor parte del oxígeno en el sistema.
Una vez que se forma el gel, se rompen los enlaces selectivos en las proteínas que mantienen unido el tejido y se agrega agua para expandir el gel. Una vez realizada la amplificación, se puede marcar y obtener imágenes de la proteína diana en el tejido.
“Este enfoque puede requerir más preparación de muestras que otras técnicas de superresolución, pero es mucho más sencillo cuando se trata de procesos de imágenes reales, especialmente imágenes en 3D”, afirma Shin. “Documentamos el protocolo paso a paso en el manuscrito para que los lectores puedan navegar fácilmente por él”.
Imágenes de pequeñas estructuras.
Utilizando esta técnica, los investigadores pudieron obtener imágenes de muchas estructuras diminutas dentro de las células cerebrales, incluidas estructuras llamadas nanocolumnas sinápticas. Se trata de grupos de proteínas que se organizan de forma específica en las sinapsis neuronales, lo que permite que las neuronas se comuniquen entre sí mediante la secreción de neurotransmisores como la dopamina.
En estudios de células cancerosas, los investigadores también tomaron imágenes de microtúbulos, tubos huecos que ayudan a dar estructura a las células y desempeñan un papel importante en la división celular. Pudieron ver la organización de las mitocondrias (orgánulos que producen energía) e incluso complejos de poros nucleares individuales (grupos de proteínas que controlan el acceso al núcleo celular).
Wang ahora está utilizando esta técnica para obtener imágenes de carbohidratos llamados glicanos, que se encuentran en las superficies celulares y ayudan a controlar las interacciones de las células con su entorno. El método también se puede utilizar para obtener imágenes de células tumorales, lo que permite a los científicos ver cómo se organizan las proteínas dentro de estas células con mayor facilidad de lo que era posible anteriormente.
Los investigadores prevén que cualquier laboratorio de biología debería poder utilizar la técnica a bajo costo porque se basa en productos químicos estándar disponibles en el mercado y en equipos comunes como microscopios confocales y bolsas de guantes, que la mayoría de los laboratorios ya tienen o pueden tener. ser de fácil acceso.
“Nuestra esperanza es que con esta nueva tecnología, cualquier laboratorio de biología tradicional pueda utilizar este protocolo con sus microscopios actuales, permitiéndoles alcanzar resoluciones que sólo pueden lograrse con microscopios de última generación altamente especializados y costosos. ” dice Wang. .
Esta investigación fue apoyada, en parte, por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., la Beca Presidencial para Graduados del MIT, las Becas de Becas de Investigación para Graduados de la Fundación Nacional de Ciencias de EE. UU., Open Philanthropy, Good Ventures, el Instituto Médico Howard Hughes, Lisa Yang, Ashar Aziz y la Unión Europea. Consejo de Investigación
