Los biosensores, dispositivos que utilizan moléculas biológicas para detectar la presencia de una sustancia objetivo, incluidos biomarcadores de enfermedades, moléculas en acción en diversos procesos biológicos o la detección de toxinas y otras sustancias nocivas en el medio ambiente, tienen un gran potencial. Uno de los tipos más comunes, los biosensores fluorescentes, consisten en una biomolécula de unión a un objetivo unida a una molécula sonda que emite luz fluorescente. Sin embargo, los biosensores fluorescentes suelen ser reactivos de bajo contraste porque sus sondas fluorescentes siempre están “encendidas” y las moléculas del biosensor no unidas deben eliminarse antes de que se pueda detectar una señal válida.
Un gran paso adelante son los “biosensores fluorescentes activados por unión” (nanosensores) de alto contraste que se iluminan sólo cuando se unen a sus moléculas objetivo, pero crear tales nanosensores para una unión objetivo eficaz es difícil desde el punto de vista técnico y requiere una fluorescencia activada. cambiar. combinados en un pequeño paquete molecular que se puede administrar de manera eficiente a una amplia variedad de muestras y se puede ampliar de manera rentable.
Ahora, un equipo de investigación colaborativo de la Universidad de Harvard, la Facultad de Medicina de Harvard (HMS), el MIT y el Instituto Wyss de la Universidad de Edimburgo (Reino Unido) ha desarrollado una plataforma de biología sintética para agilizar el descubrimiento, la evolución molecular y la fabricación rentable. ¿Qué está preparado? Nanosensores pequeños y altamente eficientes que pueden detectar proteínas, péptidos y pequeñas moléculas específicas amplificando su fluorescencia hasta 100 veces en menos de un segundo. Como componente clave, la plataforma utiliza nuevos aminoácidos fluorogénicos (FgAA) que pueden codificarse en pequeñas secuencias de proteínas (aglutinantes) que se unen al objetivo mediante un método innovador. in vitro Ampliación del código genético. A través de un proceso de detección, validación y evolución dirigida de sensores de alto rendimiento, la plataforma transforma de manera rápida y rentable los aglutinantes de proteínas en nanosensores de alto contraste para la investigación básica, el monitoreo ambiental, el diagnóstico clínico y una amplia gama de aplicaciones. Se publican mejores resultados del tratamiento. Comunicaciones de la naturaleza.
“Hemos trabajado durante mucho tiempo para ampliar el código genético de las células para dotarlas de nuevas capacidades que permitan la investigación, la biotecnología y la medicina en una variedad de campos, y este estudio es una extensión muy prometedora de ese esfuerzo. in vitrodijo el miembro principal de la facultad de Wyss, George Church, Ph.D., quien dirigió el estudio. “Esta novedosa plataforma de biología sintética resuelve muchos de los obstáculos que se han interpuesto en el camino de la mejora de las proteínas con nuevas químicas, ejemplificadas por biosensores instantáneos más eficientes, y tiene implicaciones para muchos campos biomédicos. Church es el líder de la Plataforma de Biología Sintética del Instituto Wyss y también es Profesor Robert Winthrop de Genética en HMS y Profesor de Ciencias y Tecnología de la Salud en la Universidad de Harvard y el MIT.
Una proteína más un andamio equivale a un nanosensor.
El equipo fue dirigido por el codirector y coautor correspondiente Erkin Crowe, Ph.D. En el grupo de Church, se basaron en el descubrimiento anterior de que los FgAA pueden convertir aglutinantes de proteínas conocidas en sensores ópticos cuya fluorescencia se activa cuando su FgAA se intercala entre su secuencia aglutinante y una molécula objetivo. Los investigadores de Wyss colaboraron en el estudio con el coautor Mark Wandrell, PhD, profesor de la Universidad de Edimburgo y experto en química traslacional e imágenes biomédicas con quien Coro compartió un interés temprano en los FgAA.
Al comienzo de la pandemia, el equipo imaginó por primera vez un “diagnóstico rápido de COVID-19” y se centró en un pequeño anticuerpo diseñado (nanocuerpo) que se une a la proteína de pico del SARS-CoV-2 en la superficie del virus. Crearon cientos de tipos de aglutinantes en los que esencialmente ensamblaban FgAA uniendo químicamente aminoácidos de cisteína o lisina que estaban genéticamente vinculados a uno de los 20 andamios químicos fluorogénicos diferentes en estrecho contacto con el objetivo de la púa en los lugares donde se introdujo. sucedió. Utilizando un ensayo de unión simple, seleccionaron las variantes fluorogénicas que daban el mayor aumento de fluorescencia en milisegundos tras la unión al objetivo.
Luego utilizaron el mismo proceso para diseñar nanocuerpos, o miniproteínas, que se unen a diferentes sitios objetivo del SARS-CoV-2, así como a una variedad de otros objetivos moleculares, incluidos los factores de crecimiento celular relacionados con el cáncer EGFR, un ALFA-. péptido de etiqueta utilizado por los biólogos celulares para rastrear proteínas dentro de las células y la hormona del estrés cortisol; Es importante destacar que los nanosensores también señalaron eficazmente la presencia de sus objetivos en células humanas y bacterias vivas bajo el microscopio, lo que demuestra su utilidad como herramientas eficaces de obtención de imágenes.
Evolución de nanorespuestas
A pesar de su potencial, la primera versión de la plataforma estaba limitada al depender de un proceso laborioso y lento que implicaba múltiples pasos de purificación de las secuencias de aglutinantes generadas. “Queríamos ampliar aún más nuestro espacio de diseño molecular ampliando las capacidades de alto rendimiento de la plataforma”, dijo Coro. “Para lograr esto, permitimos que el ribosoma, que sintetiza naturalmente todas las proteínas en las células, hiciera la mayor parte del trabajo en un proceso diseñado sin células”.
En la versión 2.0 de su plataforma, el equipo predisenó un llamado “aminoácido sintético” al que ya estaba adherido un andamio fluorogénico. Los aminoácidos sintéticos ya han demostrado su valor en tratamientos como el fármaco para bajar de peso Ozempic; Sin embargo, no se pueden incorporar fácilmente a secuencias de proteínas porque no existe una maquinaria natural para manipularlos por parte del ribosoma. “Para superar este obstáculo, reasignamos un codón poco utilizado en el código genético universal con la ayuda de una novedosa química de extensión genética, de modo que pudiera codificar aminoácidos sintéticos como los preformados. “Esencialmente, rediseñamos el proceso de síntesis de proteínas para “Construir nanosensores fluorescentes activados por unión”, dijo el coautor Jonathan Ritchier, Ph.D., quien coinventó el método.
Su nuevo proceso no sólo permitió a los investigadores generar millones de candidatos a nanosensores a la vez, sino que también ayudó a acelerar las pruebas posteriores de los nanosensores, ya que la síntesis completa se mezcló directamente con la molécula objetivo y se puede mezclar o agregar a células vivas. sin ningún tipo de aditivos. Pureza Ahora pueden investigar cientos de variedades al día en lugar de unas pocas docenas en el transcurso de varias semanas. Destacando el poder de la plataforma avanzada, descubrieron una posición específica para codificar sus FgAA en el nanoaglutinante original del SARS-CoV-2 que, al entrar en contacto con la proteína objetivo de la espiga, resultó en una reacción inesperada. En consecuencia, su nanosensor resultó estar más cerca relacionado con el nanosensor COVID-19 original.
Finalmente, como esto aumentaría significativamente la capacidad de crear nanosensores superiores, el equipo aprovechó su plataforma para optimizar la configuración del nanocuerpo. Aprovecharon un proceso clásico de biología sintética llamado “evolución dirigida”, en el que las proteínas se optimizan a través de ciclos de prueba iterativos de diseño y construcción que utilizan versiones de la proteína con mayor potencial en un ciclo como base para crear una mejor. se busca en un ciclo. El siguiente. Comenzando con el nanosensor perfecto que habían diseñado previamente para detectar rápidamente la proteína de pico original del SARS-CoV-2, Kuru, Rittichier y el equipo crearon extensas bibliotecas de nanocuerpos que contenían variantes que El FgAA no estándar se mantuvo en la posición original, pero muchos de los Los aminoácidos estándar fueron reemplazados por otros estructuralmente diferentes en otras posiciones clave. Refinar aún más lo mejor de ellos condujo a nuevos nanosensores con órdenes de magnitud de mayor afinidad de unión a la proteína de pico. Curiosamente, utilizando una versión adaptada de este sistema de evolución dirigida, descubrieron nanosensores que podían detectar selectivamente nuevas variantes de Omicron.
“Este es un importante paso adelante en nuestra capacidad para diseñar rápidamente biosensores fluorescentes de bajo costo para el seguimiento de enfermedades en tiempo real”, dijo Vandrell. “También podemos añadir aminoácidos sintéticos con muchas otras propiedades a todo tipo de proteínas para crear una gama muy amplia de nuevas herramientas terapéuticas y de investigación”, añadió Kuru. De hecho, Kuru y los coautores Helena de Puig, Ph.D. Y Alison Flores, junto con Church y el autor principal y miembro principal del cuerpo docente de Wyss, James Collins, PhD, también comenzaron a trabajar en el proyecto AminoX del Instituto Wyss, que aprovecha la plataforma para desarrollar nuevas terapias.
“Este trabajo innovador, que permite una generación nueva y más poderosa de biosensores activados por unión, demuestra las notables fortalezas de la biología sintética. El equipo de Wyss logró diseñar un proceso biológico fundamental en una plataforma que, en última instancia, tenía la capacidad más amplia para resolver muchos diagnósticos. y problemas terapéuticos”, dijo el director fundador de Wyss, Donald Ingber, M.D., Ph.D., quien también lo es. Profesor Judah Folkman de Biología Vascular en HMS y el Boston Children’s Hospital, y Profesor Hansjörg Weiss de Ingeniería de Inspiración Biológica en mares
Los autores adicionales del estudio son Subhrajit Root, Isaac Hahn, Abigail Reese, Thomas Bartlett, Fabio de Moliner, Sylvie Bernier, Jason Galpin, George Marchand, William Beadle, Lindsay Robinson-McCarthy, Christopher Ahern, Thomas Barnhart y David Ridner. Este estudio fue apoyado por el Wyss Institute Endorsement Project, una subvención del Departamento de Energía de EE. UU. (Premio n.° DE-FG02-02ER63445) y una subvención de consolidación del ERC (Premio n.° DYNAFLUORS, 771443), así como una beca de la Life Science Research Foundation para Kuru.
