Los científicos del St. Jude Children’s Research Hospital anunciaron hoy un método para mejorar la medición de distancias a escala molecular mediante la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de una sola molécula (smFRET). smFRET cuantifica las propiedades de excitación y emisión de sustancias químicas llamadas fluoróforos.
Cuando un electrón excitado en el fluoróforo se relaja, emite luz después de un retraso, lo que hace que la molécula brille (fluoresce). Sin embargo, los fluoróforos no siempre emiten fluorescencia después de la excitación. En cambio, a través de procesos de mecánica cuántica relacionados con el estado de “espín” del electrón excitado, pueden entrar en estados oscuros tripletes de larga duración que no emiten fluorescencia. Esto reduce la sensibilidad y precisión de las mediciones smFRET. Al controlar la duración de los estados oscuros mediante tecnologías de “autocuración”, los científicos de St. Jude ahora muestran que los estados oscuros triples se pueden reducir considerablemente. Este avance aumenta significativamente la resolución del método para avanzar en el campo de la imagen molecular. Los resultados se publicaron hoy. Los caminos de la naturaleza.
smFRET captura momentos moleculares momento a momento.
Capturar los aleteos de los colibríes requiere cámaras especiales con altas velocidades de cuadros e iluminación que evite el desenfoque del movimiento a alta velocidad. Imaginar el vuelo de un colibrí palidece en comparación con los desafíos que implica lograr las funciones de las moléculas biológicas en nuestros cuerpos. Las moléculas biológicas son más pequeñas que la longitud de onda de la luz (del orden de milmillonésimas de pulgada) y sus funciones dependen de su movimiento, cambiando de posición o de forma (estructura) de cientos a miles de veces por segundo. Para comprender verdaderamente cómo las moléculas realizan sus funciones, cómo estas funciones se alteran en las enfermedades y cómo los tratamientos farmacológicos alteran sus actividades, es importante medir estas dinámicas difíciles de alcanzar. smFRET, una técnica de imágenes moleculares, es una forma poderosa de visualizar directamente cómo se mueven las biomoléculas en tiempo real y a escala de una sola molécula.
En St. Jude, Scott Blanchard, PhD, Departamento de Biología Estructural y Biología Química y Terapéutica, lidera el campo de las imágenes smFRET. Los esfuerzos en el laboratorio Blanchard a través del Centro de imágenes de molécula única de St. Jude han sido fundamentales en el diseño y desarrollo de fluoróforos que permiten mediciones a escala molecular.
“Las moléculas fluorescentes más comunes y utilizadas generalmente no están a la altura de la tarea de cuantificar eventos a escala molecular. Esto nos llevó al desafío de sintetizar nuestros propios fluoróforos”, dijo Blanchard. “En el proceso de hacer esto, nos dimos cuenta de que era necesario cambiar la fotofísica fundamental de la fluorescencia”.
Para realizar experimentos smFRET, los investigadores colocan fluoróforos en dos puntos de una biomolécula. Cuando se dirige un láser al primero de estos fluoróforos (el donante), un electrón de su interior se excita y gana energía. Cuando el electrón se relaja, esta energía se transfiere a través del espacio a otro fluoróforo (el aceptor), pero sólo si está cerca del donante. Al registrar y cuantificar los estallidos fluorescentes de los fluoróforos tanto donantes como aceptores, se pueden medir distancias del orden de mil millonésimas de pulgada. Cada pieza de información es esencial para comprender la función y disfunción biológica. Sin embargo, el uso preciso de la técnica requiere un análisis cuidadoso de las propiedades fundamentales de la fluorescencia.
Spin electrónico bloqueado en el estado triplete
Los principios que gobiernan la emisión de luz de un fluoróforo giran en torno al espín del electrón. Cuando un electrón excitado se relaja, debe volver a su estado original, conservando su estado de espín o número cuántico de espín. Sin embargo, este no es siempre el caso.
“Siempre que un electrón se excita, es probable que pierda su memoria de espín y asuma un estado de espín invertido”, dijo Blanchard, su autor correspondiente. Los caminos de la naturaleza estudio “Aunque este proceso es relativamente raro, con una probabilidad de 1 en 100, si cambia su estado de espín, termina en el estado triplete 100.000 veces más duradero que no emite fluorescencia. Como resultado, el fluoróforo se vuelve mucho más tenue que podría ser de otra manera.
“El campo de la fluorescencia ha luchado con esto durante años”, añadió Blanchard.
FRET requiere que los fluoróforos donante y aceptor se comporten de manera similar. Pero, debido a que la técnica requiere directamente un excitador y no el otro, cuando se carga el láser, los estados triplete del donante y del aceptor se ocupan a velocidades diferentes.
“Se termina con un proceso de efecto mar en el que el donante y el aceptor se estabilizan en diferentes niveles, por lo que están perdiendo eficiencia en diferentes umbrales”, explicó Blanchard. “Las lecturas experimentales tienden a variar, lo que da como resultado una calidad y confiabilidad reducidas de los datos de imágenes. Esto limita fundamentalmente el rango de resolución espacial y temporal de las mediciones smFRET”.
Por lo tanto, un objetivo importante de los estudios de ingeniería de fluoróforos es acortar la vida útil de los estados tripletes tanto como sea posible. Éste es el objetivo principal de las tecnologías de “autocuración”.
“Para garantizar mediciones de distancia precisas en los datos smFRET, el campo actualmente se basa en medidas de calibración que no consideran explícitamente los tres estados”, explicó la coautora Zeliha Kilic, Ph.D., Departamento de Biología Estructural de St. Jude. “Las tecnologías de autorreparación acercan el campo a condiciones óptimas donde no existen estados tripletes, asegurando que los pasos de calibración produzcan resultados más precisos y, por lo tanto, mediciones de distancia”.
Los fluoróforos autorreparables marcan el camino.
Los químicos inhibidores del estado triplete, como el ciclooctatetrieno, contrarrestan esta tendencia en lugar de perder funciones. “El ciclooctatetrieno es grasoso, muestra poca solubilidad y es difícil de controlar”, dijo Blanchard.
Publicaciones anteriores del equipo de Blanchard informaron sobre el desarrollo de fluoróforos con ciclotetraeno directamente unido. Este enfoque resolvió el problema de la solubilidad y creó fluoróforos “autocurativos” en los que la ocupación de los tres estados se redujo hasta 1000 veces. En el nuevo estudio, los investigadores demostraron que el uso de fluoróforos autorreparables como donantes y aceptores en experimentos smFRET mejora la calidad y confiabilidad de los datos y previene daños al aumentar la calidad de las imágenes. Estas mejoras amplían las fronteras de smFRET, y las tecnologías de fluoróforos autorreparables están encontrando aplicaciones cada vez más diversas en todo el mundo.
“El brillo mejorado y la fotoestabilidad de los fluoróforos autorreparables hacen posible mejorar drásticamente la resolución espaciotemporal de las imágenes smFRET”, dijo el coautor Avok Pati, Ph.D., ex miembro del Departamento de Biología Estructural de St. Jude. Instituto Birla de Tecnología y Ciencia. “Ahora podemos cuantificar de forma sólida la dinámica conformacional a escala nanométrica dentro de biomoléculas individuales en concentraciones de oxígeno fisiológicas y submilisegundos”.
Blanchard confía en que estos hallazgos ayudarán a los investigadores de St. Jude y a la comunidad científica en general. “En St. Jude, ampliar las fronteras de la innovación en imágenes es parte del plan estratégico de la institución y creemos que los fluoróforos autorreparables desempeñarán un papel importante en el logro de nuestros objetivos”, afirmó. “Además, es probable que muchas personas se beneficien de estos avances porque el enfoque de autocuración ha demostrado potencial para mejorar la mayoría de las aplicaciones de fluorescencia”.
