Los sistemas CRISPR-Cas, sistemas de defensa de las bacterias, se han convertido en una importante fuente de tecnologías para el diagnóstico molecular. Los investigadores del Instituto Helmholtz para la Investigación de Infecciones basadas en ARN (HIRI) en Würzburg han ampliado esta amplia caja de herramientas. Su nuevo método, llamado PUMA, permite la detección de ARN con la nucleasa Cas12, que se dirige naturalmente al ADN. PUMA promete una amplia gama de aplicaciones y alta precisión. El equipo publicó sus hallazgos en la revista. Comunicaciones de la naturaleza.
Para protegerse de los virus, las bacterias han desarrollado mecanismos de defensa especiales, que no sólo infectan a los humanos. Como parte de estos sistemas llamados CRISPR-Cas, un ácido ribonucleico CRISPR (crRNA), que actúa como “ARN guía”, reconoce regiones genómicas extrañas, como el ADN viral. Las nucleasas asociadas a CRISPR (Cas), dirigidas por un ARNcr, luego lo cortan como un par de tijeras, volviéndolo inofensivo. Los humanos han aprovechado esta estrategia: “CRISPR, a menudo llamado ‘tijeras genéticas’, es la base de muchas tecnologías moleculares”, afirma Chase Bessel, director del Instituto Helmholtz para la Investigación de Infecciones Basadas en ARN (Jefe del Departamento de ARN Sintético Biología en HIRI). ) en Wurzburgo. El instituto es la sede del Centro Helmholtz de Braunschweig para la Investigación de Infecciones (HZI) en colaboración con la Julius-Maximilians-Universität (JMU) de Würzburg, donde Beisel tiene una cátedra.
La plataforma de diagnóstico LEOPARD, desarrollada por el laboratorio de Basilea en colaboración con JMU en 2021, también utiliza CRISPR como tecnología. Leopard tiene la capacidad de detectar una variedad de biomarcadores relacionados con enfermedades en una sola prueba. El enfoque se basa en la reprogramación de factores de ARN, los llamados tracrRNA. Esos ARN participan naturalmente en ayudar a la producción de ARN guía utilizados por Cas9 y varias nucleasas Cas12. “LEOPARD se centró en Cas9. Sin embargo, los sistemas CRISPR-Cas también incluyen otro conjunto diverso de nucleasas, llamado Cas12”, explica Bissell. Si bien Cas9 y Cas12 cortan objetivos de ADN, Cas12 puede amplificar la señal de salida cortando ADN “colateral”. Esto puede hacer que las tecnologías de detección sean más sensibles y, por tanto, más efectivas.
El equipo dirigido por Chase Beisel ha ampliado las propiedades únicas de LEOPARD a Cas12. Los investigadores llamaron al método resultante PUMA (PAGARNtracr programables Ud.nlock adyacente al protoespaciador METRODetección independiente de Otif de ácido ribonucleico. Ohcids por nucleasas Cas12). Los detalles de sus hallazgos son el tema de un artículo en la revista. Comunicaciones de la naturaleza.
Superando obstáculos
Aunque las nucleasas Cas12 se utilizan ampliamente en el diagnóstico molecular, persisten dos limitaciones importantes: las tecnologías basadas en Cas12 se limitan a objetivos de ADN y a una secuencia de reconocimiento específica conocida como PAM, para abreviar. Forma adyacente al protoespaciador.Esencial para el reconocimiento de la molécula objetivo.
PUMA resuelve estos desafíos maravillosamente. Al igual que LEOPARD, este nuevo método también se basa en tracrRNA. “Utilizando PUMA, podemos reprogramar los ARNtracr. Esto nos permite decidir qué biomarcador de ARN se convierte en un ARN guía. Este ARN guía, a su vez, dirige Cas12 a una molécula de ADN, a la que proporcionamos y activamos la escisión genética”, explica el primero. de El estudio. Autor, Chunli Jiao. Chunlei Jiao, ex estudiante de posgrado e investigador postdoctoral en el laboratorio de Beisel, también participó en el desarrollo de Leopard. Recientemente asumió una cátedra en la Universidad Nacional de Singapur. “El corte de ADN nos dice qué biomarcadores estaban presentes en la muestra, como biomarcadores específicos para diferentes patógenos”, dice Bissell.
Por tanto, el nuevo método permite la detección de biomarcadores de ARN utilizando nucleasas CRISPR que normalmente sólo pueden reconocer el ADN. “Esto es especialmente importante para los biomarcadores moleculares que sólo pueden detectarse a nivel de ARN. Por ejemplo, los virus de ARN”, afirma Bissell. Sin embargo, PUMA no requiere una secuencia de reconocimiento específica: el ADN proporcionado por PAM está presente en la molécula objetivo. Como los investigadores proporcionan la molécula objetivo, también pueden introducir el ADN fragmentado. Como resultado, pudieron aumentar significativamente la velocidad del procedimiento.
Muchos pájaros, un tiro
“PUMA tiene potencial para ser una herramienta flexible y precisa para la detección de ARN”, concluyó Beisel. Finalmente, el equipo demostró el potencial del método al identificar cinco patógenos bacterianos asociados con la sepsis grave. Su detección depende de un único ARNtracr reprogramado universal, que proporciona un medio sencillo para distinguir entre diferentes tipos de bacterias. Esto abre una amplia gama de aplicaciones potenciales en medicina: “La nueva tecnología representa una nueva forma de diagnóstico CRISPR que permite realizar pruebas moleculares fiables en el lugar de atención, ya sea para identificar patógenos virales o bacterianos. Ya sea para identificar biomarcadores del cáncer o para identificarlos”. , dice Jiao.
El equipo de investigación ya está planificando sus próximos pasos: “Nuestro objetivo es lograr una lectura múltiple similar a LEOPARD y ampliar la gama de aplicaciones de esta tecnología”, afirma Bissell, ampliamente conocido en la comunidad investigadora. También se espera que utilice: “Esperamos que nuestro estudio promueva una mayor exploración de la reprogramación del ARNtracr”.
