Cada planta, animal y ser humano es un rico microcosmos de células diminutas y especializadas. Estas células son un mundo en sí mismas, cada una con sus propias partes y procesos únicos que van más allá del ojo desnudo. Ver el funcionamiento interno de estos bloques de construcción microscópicos con una resolución nanométrica sin dañar sus delicados órganos ha sido un desafío, pero científicos de diversas disciplinas del Laboratorio Nacional Brookhaven del Departamento de Energía de EE. UU. (DOE) han encontrado un método eficaz. Una célula que utiliza múltiples técnicas. Se publicó el interesante proceso de obtención de estas imágenes. Biología de la comunicación.
Ser capaz de comprender la estructura interna de las células, la forma en que las sustancias químicas y las proteínas interactúan dentro de ellas y cómo estas interacciones dictan ciertos procesos biológicos con una resolución nanométrica ha llevado a avances en la medicina, la agricultura y muchos otros campos importantes que pueden tener efectos significativos. Este trabajo también está allanando el camino para mejorar las técnicas de imágenes biológicas y nuevos dispositivos para mejorar las imágenes biológicas.
“Estudiar las células humanas y los orgánulos dentro de ellas es apasionante”, afirmó Qun Liu, biólogo estructural del laboratorio de Brookhaven, “pero hay muchas oportunidades para aprovechar nuestro enfoque multimodal que combina la tomografía computarizada con rayos X duros y los rayos X”. “Imágenes de fluorescencia. Podemos estudiar hongos patógenos o bacterias beneficiosas. Podemos ver no sólo la estructura de estos microorganismos, sino también los procesos químicos cuando las células interactúan de diferentes maneras”.
Quitar uno de los pilares de la vida
Antes de que los investigadores comenzaran a obtener imágenes, su mayor desafío era preparar la muestra en sí. El equipo decidió utilizar una célula de la línea 293 del riñón embrionario humano (HEK). Se sabe que estas células son fáciles de cultivar pero difíciles de tomar múltiples mediciones de rayos X. Aunque son muy pequeñas, las células son muy sensibles al daño causado por los rayos X.
Los científicos pasaron por un proceso cuidadoso de varios pasos para fortalecer la muestra. Usaron paraformaldehído para preservar químicamente las estructuras celulares, luego un robot congeló instantáneamente las muestras colocándolas en etano líquido, transfiriéndolas a nitrógeno líquido y finalmente eliminando el agua, pero las estructuras celulares las liofilizaron para preservarlas. Una vez que se completó el proceso, los investigadores colocaron las células liofilizadas bajo un microscopio y las etiquetaron para obtener imágenes específicas.
Con sólo 12-15 micrones de diámetro (el cabello humano promedio tiene 150 micrones de espesor), configurar la muestra para la medición no fue fácil, especialmente para mediciones en diferentes líneas de luz. El equipo necesitaba garantizar que la estructura celular pudiera sobrevivir a múltiples mediciones con rayos X de alta energía sin sufrir daños y que la célula pudiera mantenerse en su lugar de manera confiable para múltiples mediciones. Para superar estos obstáculos, los científicos desarrollaron soportes de muestras estandarizados para usar en múltiples instrumentos e implementaron microscopios ópticos para localizar y obtener imágenes rápidamente de las células y minimizar las exposiciones prolongadas a los rayos X que pueden dañarlas.
Medición multimodal
El equipo utilizó dos técnicas de imágenes que se encuentran en la Fuente Nacional de Luz de Sincrotrón II (NSLS-II), una instalación para usuarios de la Oficina de Ciencias del DOE en Brookhaven: tomografía computarizada de rayos X (XCT) y microscopía de fluorescencia de rayos X (XRF).
Los investigadores recopilaron datos XCT, que utilizan rayos X para informar a los científicos sobre la estructura física de una célula, en la línea de luz de imágenes de rayos X de campo completo (FXI). La tomografía utiliza rayos X para mostrar una sección transversal de una muestra sólida. Un ejemplo familiar es la tomografía computarizada, que utilizan los profesionales médicos para crear una imagen transversal de cualquier parte del cuerpo.
Los investigadores recopilaron datos de microscopía XRF, que proporcionan más pistas sobre la distribución de elementos químicos dentro de la célula, en la línea de luz de espectroscopía de rayos X de resolución submicrónica (SRX). En esta técnica, los investigadores dirigen rayos X de alta energía a una muestra, lo que excita el material y hace que emita fluorescencia de rayos X. La emisión de rayos X tiene una firma propia y única, que permite a los científicos saber qué elementos contiene una muestra y cómo se distribuyen para llevar a cabo sus funciones biológicas.
“Nos inspiramos a combinar imágenes XCT y XRF basándonos en la información única y complementaria que cada una proporciona”, dijo Xianghui Xiao, científico principal de líneas de luz en FXI. “La fluorescencia nos brinda mucha información útil sobre los oligoelementos dentro de las células y cómo se distribuyen. Esta es una información muy importante para los biólogos. Obtener un mapa de fluorescencia de alta resolución en muchas células requiere mucho tiempo. Sin embargo, puede ser exigente. Para una imagen 2D, puede llevar varias horas”.
Aquí es donde resulta útil obtener una imagen 3D de la célula mediante XCT. Esta información puede ayudar a guiar las mediciones de fluorescencia en puntos de interés específicos. Esto ahorra tiempo a los científicos, aumenta el rendimiento y también garantiza que no sea necesario exponer la muestra a rayos X durante largos períodos de tiempo, lo que puede dañar las células frágiles y minimizar el daño potencial.
“Este enfoque de correlación proporciona información útil y complementaria que puede promover muchas aplicaciones prácticas”, comentó Yang Yang, científico de líneas de luz en SRX. “Para algo como la administración de fármacos, se pueden identificar subconjuntos específicos de orgánulos y luego se pueden rastrear elementos específicos a medida que se redistribuyen durante el tratamiento, lo que nos da una imagen más clara de cómo funcionan estos fármacos a nivel celular”.
Aunque estos avances en imágenes han proporcionado una mejor visión del mundo celular, todavía quedan desafíos por enfrentar y formas de mejorar aún más las imágenes. Como parte del proyecto NSLS-II Experimental Tools III, un plan para construir nuevas líneas de luz para proporcionar nuevas capacidades a la comunidad de usuarios, Yang es el líder científico del equipo que trabaja en la próxima línea de luz de Tomografía Celular Cuantitativa (QCT). que estará dedicado a la bioimagen. QCT es una línea de luz de tomografía de rayos X suaves de campo completo para obtener imágenes de células congeladas con resolución a nanoescala sin necesidad de fijación química. Esta línea de luz de tomografía de rayos X de Cryosoft complementará los métodos existentes y proporcionará más detalles sobre la estructura y función celular.
Resultados futuros
Si bien es emocionante poder observar las células que forman los sistemas del cuerpo humano, poder comprender los patógenos que invaden y alteran estos sistemas puede ayudar a los científicos a combatir las enfermedades infecciosas.
“Esta tecnología nos permite estudiar la interacción entre un patógeno y su huésped”, explicó Liu. “Podemos observar el patógeno y una célula sana antes de la infección y luego obtener imágenes durante y después de la infección. Veremos cambios estructurales tanto en el patógeno como en el huésped y comprenderemos mejor el proceso. “También podemos estudiar las interacciones entre bacterias beneficiosas en el microbioma humano que tienen una relación simbiótica con las plantas”.
Liu está trabajando actualmente con científicos de otros laboratorios y universidades nacionales para el Programa de Investigación Biológica y Ambiental del DOE para estudiar las interacciones moleculares entre el sorgo y el sorgo. Colletotrichum sublinola, Hongo patógeno que causa antracnosis, que puede dañar las hojas de las plantas. El sorgo es un importante cultivo bioenergético del DOE y el quinto cultivo de cereales más importante del mundo, por lo que comprender las tácticas de este hongo destructivo y cómo funcionan las defensas del sorgo a nivel celular y molecular tendrá mucho que ganar.
Ser capaz de ver a esta escala puede dar a los científicos una idea de las guerras que libran los patógenos en los cultivos, el medio ambiente e incluso los cuerpos humanos. Esta información puede ayudar a desarrollar las herramientas adecuadas para luchar contra estos atacantes o reparar sistemas que no funcionan de manera óptima en un nivel básico. El primer paso es poder ver un mundo que el ojo humano no puede ver, y los avances en la ciencia sincrotrón han demostrado ser una herramienta poderosa para descubrirlo.
Este trabajo fue apoyado por fondos de investigación y desarrollo dirigidos por laboratorios de Brookhaven y la Oficina de Ciencias del DOE.
